豬圓環(huán)1型/偽狂犬PCV-2/PRV）熒光PCR試劑盒分別對禽流感病毒 H7N9 亞型的 HA 和 NA 基因設(shè)計特異性的引物和探針[2-3]，用一步法熒光 RT-PCR 技術(shù)對禽流感病毒 H7N9 RNA 進(jìn)行體外擴(kuò)增檢測，用于臨床上對可疑感染者的病原學(xué)診斷。
本試劑盒適用于檢測標(biāo)本中的禽流感病毒 H7N9，適用于禽流感病毒 H7N9 感染的輔助診斷及流行病學(xué)調(diào)查。

豬圓環(huán)1型/偽狂犬PCV-2/PRV)熒光PCR試劑盒說明書

【產(chǎn)品名稱】

商品名稱：豬圓環(huán)病毒1型/豬圓環(huán)病毒2型/偽狂犬病毒(PCV-1/PCV-2/PRV)核酸檢測試劑盒(熒光-PCR法)?

Name ：Porcine circovirus type 1 / porcine circovirus type 2 / pseudorabies virus (PCV-1/PCV-2/PRV) nucleic acid detection kit (fluorescent -PCR method)?

【包裝規(guī)格】48T/盒

【預(yù)期用途】

本試劑盒適用于檢測標(biāo)本中的禽流感病毒 H7N9，適用于禽流感病毒 H7N9 感染的輔助診斷及流行病學(xué)調(diào)查。

【檢驗原理】

本試劑盒分別對禽流感病毒 H7N9 亞型的 HA 和 NA 基因設(shè)計特異性的引物和探針[2-3]，用一步法熒光 RT-PCR 技術(shù)對禽流感病毒 H7N9 RNA 進(jìn)行體外擴(kuò)增檢測，用于臨床上對可疑感染者的病原學(xué)診斷。

注：

1）不同批號試劑不能混用。

2）試劑盒內(nèi)各試劑組份足夠包裝規(guī)格所標(biāo)示的檢測次數(shù)。

【儲存條件及有效期】

-20℃±5℃，避光保存、運輸、反復(fù)凍融少于 7 次，有效期 9 個月。

【適用儀器】

ABI 系列 、安 捷倫 MX3000P/3005P 、MJ Opticon2、Eppendorf 2/4 Color Systems、Bio-RadCFX96 等熒光定量 PCR 檢測儀。

【標(biāo)本采集】

病死或撲殺禽，取喉氣管、腦、胸肌、心肌和肺等組織；待檢活禽，用棉拭子取呼吸道分泌物或排泄物，置于 1mL 50%甘油生理鹽水中。

【保存和運輸】

上述標(biāo)本短期內(nèi)可保存于-20℃，長期保存可置-70℃，但不能超過 6 個月，標(biāo)本運送應(yīng)采用 2~8℃冰袋運輸，嚴(yán)禁反復(fù)凍融。

【使用方法】

1. 樣品處理（樣本處理區(qū)）

1.1樣本前處理

每份組織分別從 3 個不同的位置稱取樣品約 1g，手術(shù)剪剪碎混勻后取 0.5g 于研磨器中研磨，加入 1.5mL 生理鹽水后繼續(xù)研磨，待勻漿后轉(zhuǎn)至 1.5mL 滅菌離心管中，8000rpm 離心 2min，取上清液 100μL 于 1.5mL 滅菌離心管中；棉拭子直接取 100μL 提取。

1.2RNA 提取

推薦采用上海晅科生物科技有限公司生產(chǎn)的 RNA 提取試劑盒（離心柱提取法），請按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。

2. 試劑配制（試劑準(zhǔn)備區(qū)）

根據(jù)待檢測樣本總數(shù)，設(shè)所需要的 PCR 反應(yīng)管管數(shù)為 N(N=樣本數(shù)+1 管陰性對

照+1 管陽性對照；樣品每滿 7 份，多配制 1 份)，每測試反應(yīng)體系配制如下表：

試劑 AIV-H7N9 反應(yīng)液 酶液

用量 20μL 1μL

將混合好的測試反應(yīng)液分裝到 PCR 反應(yīng)管中，21uL/管。

3. 加樣（樣本處理區(qū)）

將步驟 1 提取的 RNA、陽性質(zhì)控品、陰性質(zhì)控品各取 4μL，分別加入相應(yīng)的反

應(yīng)管中，蓋好管蓋，混勻，短暫離心。

7. 質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)

陰性質(zhì)控品：無明顯擴(kuò)增曲線且無 Ct 值顯示；

陽性質(zhì)控品：擴(kuò)增曲線有明顯指數(shù)生長期，且 Ct 值≤32；

以上條件應(yīng)同時滿足，否則實驗視為無效。

【參考文獻(xiàn)】

[1] Morens D M, Taubenberger J K, Fauci A S. H7N9 avian influenza A virus and the perpetual challenge of potential human pandemicity [J]. MBio，2013, 4(4): e00445-13. [2] 羅思思, 謝芝勛, 劉加波, 等. H7N9 亞型 AIV 雙重實時熒光定量 RT-PCR 檢測方法的建立[J]. 動物醫(yī)學(xué)進(jìn)展, 2013, 34(12):1-5. [3] 徐曉龍, 包紅梅, 馬 勇, 等. H7 和 N9 亞型及 A 型流感病毒多重?zé)晒?RT-PCR 檢測方法的建立[J].中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報, 2014, 12, 36: 939-942.

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