鯊魚源性成分（Shark）熒光PCR核酸檢測試劑盒針對鯊魚源性成分基因高度保守區基因序列設計特異性引物和熒光探針。在反應體系中含鯊魚源性成分基因組模板的情況下，PCR反應得以進行并釋放熒光信號。利用熒光定量PCR儀對PCR過程中相應通道的信號強度進行實時監測和輸出，實現檢測結果的定性、定量分析。

鯊魚源性成分(Shark)熒光PCR核酸檢測試劑盒說明書

【產品名稱】

通用名稱：?鯊魚源性成分(Shark)?核酸檢測試劑盒(熒光-PCR 法)

Name   ：Shark nucleic acid detection kit (fluorescence-PCR)

【包裝規格】48T/盒

【預期用途】

動物源性成分廣泛分布于食品、飼料、化妝品等，與人們的生活息息相關，其中食品和飼料所占的比例大。肉及肉制品摻假成為世界各國共同關注的熱點問題，肉食品及其飼料的安全隱患直接關系到人類的安危。近幾十年來，以PCR技術為核心的動物源性成分檢測獲得了廣泛應用。

本試劑盒適用于動物組織以及食品、飼料等樣本中鯊魚源性成分的檢測。

【檢驗原理】

本試劑盒對鯊魚源性成分基因保守區設計特異性的引物和探針[1-3]，用熒光 PCR 技術對核酸進行體外擴增檢測，從而達到快速檢測之目的。

【試劑組成】

名 稱 規 格

酶液 50μL×1 管

Chicken 反應液 1.0mL×1 管

Chicken 陽性質控品 50μL ×1 管

陰性質控品 250μL ×1 管

注：

1）不同批號試劑不能混用。

2）試劑盒內各試劑組份足夠包裝規格所標示的檢測次數。

【儲存條件及有效期】

-20℃±5℃，避光保存、運輸、反復凍融次數不超過 5 次。有效期 12 個月。

【適用儀器】

ABI 、安捷倫 MX3000P/3005P、MJ Opticon2、LightCycler480、Bio-Rad、eppendorf 等系列熒光定量 PCR 檢測儀。

【標本采集】

取動物組織及其制品、食品或飼料約 1g。

【保存和運輸】

上述標本短期內可保存于-20℃，長期保存可置-70℃。但不能超過6個月，標本運送應采用0℃。

【使用方法】

1.樣品處理（樣本處理區）

1.1樣本前處理：

取動物組織及其制品、食品或飼料約 1g，手術剪剪碎混勻后取 0.5g 于研磨器中研磨，加入 1.5mL 生理鹽水后繼續研磨，待勻漿后轉至 1.5mL 滅菌離心管中，8000rpm 離心 2min，取上清液 100μL 于 1.5mL 滅菌離心管中。

1.2DNA 提取

DNA 的提取推薦采用上海晅科生物科技有限公司生產的DNA 提取試劑盒（離心柱提取法），請嚴格按照試劑盒說明書進行操作。

2.試劑配制（試劑準備區）

根據待檢測樣本總數，設所需要的 PCR 反應管管數為 N(N=樣本數+1 管陰性對照+1 管陽性對照；樣品每滿 7 份，多配制 1 份)，每測試反應體系配制如下表：

步驟 循環數 溫度 時間 收集熒光信號

1 1 cycle 95℃ 10min 否

2 40 cycles 94℃ 15sec 否

55℃ 30sec 是

5.結果分析判定

5.1結果分析條件設定

設置 Baseline 和 Threshold：一般直接按機器自動分析的結果分析，當曲線出現整體傾斜時，根據分析后圖像調節 Baseline 的 start 值(一般可在 3~15 范圍內調節)、stop 值(一般可在 5~20 范圍內調節)，以及 Threshold 的 Value 值(上下拖動閾值線至高于陰性對照)，重新分析結果。

5.2判斷

a)檢測通道 Ct 值＜30.0，有 FAM 熒光信號檢出，并出現明顯的擴增曲線，判斷樣品為陽性。

b)當 30.0≤Ct 值≤35.0 時，且有明顯的擴增曲線時，則需重復實驗。再次擴增后檢測體系的Ct 值仍≤35.0，且有明顯的擴增曲線，則判定該樣品含有相應的動物源性成分。當再次擴增后，檢測體系 Ct 值＞35.0，或無明顯的擴增曲線，則判定該樣品不含相應的動物源性成分。

6.檢測方法的局限性

1）樣本檢測結果與樣本收集、處理、運送以及保存質量有關；

2）樣本提取過程中沒有控制好交叉污染，會出現假陽性結果；

3）陽性對照、擴增產物泄漏，會導致假陽性結果；

4）病原體在流行過程中基因突變、重組，會導致假陰性結果；

5）不同的提取方法存在提取效率差異，會導致假陰性結果；

6）試劑運輸，保存不當或試劑配制不準確引起的試劑檢測效能下降，出現假陰性或   定量檢測不準確的結果；

7）本檢測結果僅供參考，如須確診請結合臨床癥狀以及其他檢測手段。

7.質控標準

a)空白對照：無FAM 熒光信號檢出或 Ct 值≥35.0，未出現典型的擴增曲線。

b)陰性對照：無FAM 熒光信號檢出或 Ct 值≥35.0，未出現典型的擴增曲線。

c)陽性對照：有 FAM 熒光信號檢出，并出現典型的擴增曲線，Ct 值＜30.0。

d)以上應同時滿足，否則本次實驗無效。

【注意事項】

1）所有操作嚴格按照說明書進行；檢驗過程中，參照《GB/T 27403 實驗室質量控制規范 食品分子生物學檢測》的規定進行。

2）試劑盒內各種組分使用前應自然融化，混勻并短暫離心；

3）反應液應避光保存；

4）反應中盡量避免氣泡存在，管蓋需蓋緊；

5）使用一次性吸頭、一次性手套和各區工作服；

6）樣本處理、試劑配制、加樣需在不同區進行，以免交叉污染；

7）實驗完畢后用 10%次氯酸或 75%酒精或紫外燈處理工作臺和移液器；

8）試劑盒里所有物品應視為污染物對待，并按照《微生物生物醫學實驗室生物安全   通則》進行處理。

【參考文獻】

[1]商務部. SB/T 10923-2012 肉及肉制品中動物源性成分的測定實時熒光 PCR 法[S]. 北京:中國標準出版社, 2012.

[2]王琰. 兔源性食品的PCR-mtDNA 鑒別[J]. 山東師范大學, 2013.

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